在西方国家，心血管疾病（CVD）是导致发病率和死亡率高的主要原因，2型糖尿病（T2DM）患者发生CVD和重大心血管不良事件（MACE：心衰梗死、中风、死亡）风险更高，且预后较差。传统的CVD风险指标以及T2DM的血糖控制都不能很好地预测T2DM患者发生CVD的风险。
美国克利夫兰医学中心的StanleyL.Hazen团队通过代谢组学分析发现苯丙氨酸与T2DM患者发生CVD风险升高有关，该物质被肠道微生物代谢生成苯乙酰谷氨酰胺（PAGln），进一步研究显示PAGln在驱动心血管疾病中发挥重要作用，相关研究成果发表于国际知名期刊《Cell》。
非靶向代谢组学发现PAGln与CVD相关
对名受试者（发现集）血浆进行非靶向代谢组学检测，基于三个筛选策略：
(1)与3年发生重大心血管不良事件(MACE=心肌梗死、中风或死亡)相关；
(2)T2DM患者中水平升高；
(3)与血糖控制指数相关性较差。
研究发现一种与MACE最相关未知物（m/z.）满足筛选标准（图1A,B），经鉴定该物质为PAGln（图1C）。建立该物质同位素液相色谱串联质谱(LC/MS/MS)绝对定量方法，对另一独立队列（n=4,，验证集）进行PAGln靶向验证，该队列中T2DM受试者和MACE受试者血浆PAGln水平都相对较高。
Kaplan-Meier生存分析显示，高PAGln水平与MACE高风险显著相关（图1D），较高的PAGln水平仍是MACE风险的独立预测因子（图1E）。
绘云生物非靶向代谢组学研究发现图1.非靶向代谢组学研究发现m/z.的代谢物与心血管疾病风险相关，鉴定为苯乙酰谷氨酰胺
肠道菌群在体内参与产生PAGln和PAGly
通过检测基线（Pre-Abx）、7天广谱复合抗生素处理（Abx）和3周清除期菌群重塑（Post-Abx）的血浆PAGln水平（n=15），发现PAGln水平受肠道微生物影响（图2A）。
有研究表明，PAGln由苯乙酸（PAA）与谷氨酰胺（Gln）在肝酶的作用下形成，而PAA由苯丙氨酸（Phe）经菌群代谢产生。
此外，PAA也可与甘氨酸（Gly）结合形成苯乙酰甘氨酸（PAGly）。研究人员评估了健康受试者（n=25）和小鼠体内PAGly及PAGln水平，结果发现，人体中以PAGln为主，而小鼠中以PAGly为主（图2B），小鼠腹腔注射PAA后，主要生成PAGly（图2C）。比较常规饲养和GF小鼠或Abx干预前后的血清PAGly水平，表明肠道菌群是生成PAGly的重要参与者（图2B,2D）。
因此，在人类和小鼠中，PAGln和PAGly都是通过一种代谢途径产生，饮食中的Phe通过肠道菌群转化为PAA，宿主与Gln（人类）或Gly（啮齿动物）发生共轭反应，分别产生PAGln和PAGly（图2E）。
绘云生物非靶向代谢组学研究发现图2.人和小鼠体内产生PAGln是一个微生物依赖的过程
PAGln增强血小板反应性-加速血小板凝块形成-增加血栓风险
根据人PAGln水平与血栓事件正相关性，提示PAGln可影响血小板功能和血管基质相互作用。研究结果显示，PAGln加速了胶原依赖性血小板粘附和扩散速度（图3A-3C），并呈现剂量依赖性（3D,3E），表明PAGln可能与血小板直接相互作用，促进胞质内Ca2+浓度（[Ca2+]i）呈现依赖性升高，并进行了相关验证（图3G）。
此外，在PAGly实验中也观察到类似结果。因此，肠道菌群相关代谢产物PAGln和PAGly显著影响血小板功能，增强血小板与胶原基质的粘附，以及血小板刺激依赖性[Ca2+]i升高和对激动剂的聚集反应。
通过FeCl3诱导的颈动脉损伤模型研究发现，PAGln和PAGly都能加剧损伤的颈动脉内血栓形成（图4A），且与对照组相比，相应地减少了损伤后血流停止的时间（即闭塞时间）（图4B）。
绘云生物图3.PAGln增强血小板反应性肠道菌群基因porA和fldH调节宿主体内血栓形成
有研究报道Phe主要由生孢梭菌（Clostridiumsporogenes）代谢为PAA（氧化途径）和苯丙酸（PPA）（还原途径），随后分别与Gln或Gly缩合形成PAGln或PAGly。其中参与反应的酶主要由porA或fldH基因编码。于是作者构建了porA或fldH基因缺失的C.sporogenes突变株。
结果显示，含有功能性基因porA和fldH的(ΔcutC)C.sporogenes仅产生同位素标记的PPA，而不产生PAA；（ΔcutC,ΔfldH）C.sporogenes(具有porA功能)不再产生PPA；（ΔcutC,ΔporA）C.sporogenes（具有fldH功能）不再产生PAA（图4C）。然后通过突变株定植GF小鼠以及颈动脉损伤实验表明，基因porA主要影响PAA产生，而fldH主要调节PPA产生，且敲除fldH会增加PAA水平继而影响PAGly水平从而显著降低血栓形成。
绘云生物图4.PAGln与PAGly图4.PAGln与PAGly增强体内血栓形成潜能
PAGln通过G蛋白偶联受体发挥作用
已知PAGln可以影响细胞受体-配体之间的相互作用，而本研究中PAGln诱导的DMR细胞反应是否通过GPCR信号通路调节？
研究结果显示，GPCR信号通路调节剂和抑制剂均显著降低了PAGln诱导的DMR反应（图5A，5B）。进一步研究发现PAGln可影响cAMP水平，并证实PAGln在多个细胞中包括分离出的人血小板中通过GPCR(s)介导细胞反应。
研究人员发现PAGln与儿茶酚胺结构相似（图5E），暗示PAGln通过肾上腺素能受体（ADRs）发挥作用。遗传和药理学方法的功能丧失和功能获得研究证实，PAGln可通过G蛋白偶联受体（包括α2A，α2B和β2-ADRs）介导细胞反应（图5和图6A,B）。
绘云生物代谢组学图5.PAGln通过G蛋白偶联受体和ADR介导细胞反应
选择性ADR抑制剂可减弱PAGln诱发的血小板高反应性和血栓生成速率
基于上述结果，作者考察了抑制ADR阻滞剂对PAGln诱导的血栓形成的影响，结果显示，β受体阻滞剂（卡维地洛）可显著降低PAGln诱导的高血栓风险。
绘云生物代谢组学图6.PAGln通过ADRs调节血小板功能和体内血栓形成的潜能
小结
这项研究通过两个临床队列（包括5多人）的非靶向和靶向代谢组学研究发现了一种新的心血管疾病相关的肠道菌群代谢衍生物——苯乙酰谷氨酰胺（PAGln），体内外实验揭示了该物质的菌群和宿主代谢途径，以及促进血栓形成的分子机制。β受体阻滞剂治疗对某些CVD患者有诸多临床益处(如降低心脏病发作、中风、心力衰竭和死亡的风险)。综上，肠道菌群-代谢物在心血管等临床疾病中发挥着不容忽视的重要作用。
参考文献
Nemetetal.ACardiovascularDisease-LinkedGutMicrobialMetaboliteActsviaAdrenergicReceptors.,Cell,–.